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AW系列全自动工作站是根据Western Blot实验需要，通过仪器代替繁琐、重复、枯燥的人工试验。AW-12是太阳集团www0638自主研发的一款全自动化的Western Blot操作系统，自动化实现制冷低温储存、封闭、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套流程。数控操作流程可避免手工的操作误差，降低背景，提高信噪比和相对灵敏度，确保同批次和不同批次间实验的可重复性。

1 实验目的

AW-12全自动清洗工作站应用，进行手工和仪器处理的效果对比，验证仪器使用的可靠性。

2 实验原理

蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

3 实验准备

3.1 实验试剂

3.2 实验仪器

3.3 样品制备

3.3.1 细胞准备（293T细胞为例）

3.3.1.1 细胞复苏

将冻存的细胞从液氮中取出，并立即放入37℃水浴中，左右晃动冻存管直至管内液体全部融解。然后将液体加入装有 9mL 培养基的离心管中，立即混匀。离心4℃，300×g，5min。弃去上清，细胞沉淀用10% FBS、5ml 双抗（青霉素10000U/ml，链霉素10000U/mL）的DMEM高糖完全培养基悬浮后转入培养瓶中，最后将细胞培养瓶放进37℃，5% CO2 培养箱培养。

3.3.1.2 细胞培养

293T细胞DMEM高糖完全培养基培养，置于37℃，5% CO2 饱和湿度培养箱内，当293T细胞生长至培养皿底部90%左右时传代，用含有0.25%胰酶的细胞消化液消化，消化一段时间后用含有血清的完全培养基终止，传代或铺板。待细胞处于对数生长期时进行实验。

3.3.2 蛋白裂解

（1）从细胞房CO2培养箱中取出细胞拿回实验室进行操作。

（2）用移液器吸取细胞培养皿中的细胞培养液弃去，每个细胞培养皿中加入预冷的PBS 清洗一遍，弃去PBS。（一定要吸净，否则会影响蛋白的浓度)。加入适量的细胞裂解液进行裂解（10cm 细胞培养皿中大约加500μl），轻轻摇晃均匀。

（3）冰上裂解20分钟。

（4）裂解后的细胞小心的用移液枪吹打，尽量不要吹出气泡。吸取液体，置于预先标记好的EP管中，在冷冻离心机中12000×g离心15分钟（全部操作都要在冰上进行，冷冻离心机要提前预冷)。

（5）吸取离心后的上清液转移至预先标记好的新的EP管中，注意不要吸到沉淀，可以用冷冻离心机瞬离，保证没有气泡。进行下一步处理或保存于-80℃冰箱。

3.3.3 煮样

利用BCA试剂盒测蛋白样品的浓度，并将其总蛋白浓度制成3mg/ml，加5×loading buffer振荡混匀后，置于100℃金属浴中10min，蛋白变性，制好的蛋白样待上样或保存在-20℃。